Analiza javnih podataka
Podaci o lozama SARS-CoV-2 i datum uzimanja uzorka iz sekvenci dostupnih iz Čilea dobiveni su sa web mjesta Consorcio Genomas CoV2 dostupnog na https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Podaci o cijepljenju dobiveni su iz javnih podataka Ministarstva znanosti, tehnologije, znanja i inovacija dostupnih na adresi https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Proizvod 83).
Test infektivnosti
Pseudotipizirani virusi koji nose različite proteine SARS-CoV-2 su pripremljeni kako smo prethodno opisali12. Ukratko, pseudotipovi SARS-CoV-1 zasnovani na HIV-2 proizvedeni su u stanicama HEK293T transfekcijom pNL4.3-ΔEnv-Luc zajedno s odgovarajućim vektorom kodiranja pCDNA-SARS-CoV-2 u molarnom omjeru 1: 1. Plazmidi koji kodiraju klas optimiziran za kodon bez posljednjih 19 aminokiselina C-terminalnog kraja (SΔ19) za koje je poznato da izbjegavaju zadržavanje na endoplazmatskom retikulumu12 su dobivene sintezom gena ili prilagođenom mutagenezom usmjerenom na mjesto (GeneScript) i sadržavale su sljedeće mutacije: loza A (referentna sekvenca), linija B (D614G), linija B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), linija P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) i linija C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Svaki pripravak pseudotipa je očišćen centrifugiranjem na 859 o / min na sobnoj temperaturi, kvantificiran pomoću HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), alikvotiran u 24% fetalnog goveđeg seruma (Sigma-Aldrich) i pohranjen na -50 ° C do koristiti. Različite količine pseudotipiziranih virusa (kako je određeno razinama proteina HIV-80 p1) korištene su za infekciju HEK-ACE24 stanica, a 2 sati kasnije aktivnost luciferaze krijesnika mjerena je pomoću reagensa za ispitivanje luciferaze (Promega) u Glomax 48 mikroploči luminometar (Promega).
Neutralizacijski test
Pseudotipizirani testovi neutraliziranja virusa izvedeni su u biti kao što smo prethodno opisali12. Ukratko, serijska razrjeđenja uzoraka plazme (1: 4 do 1: 8748) pripremljena su u DMEM -u s 10% fetalnog goveđeg seruma i inkubirana s 5 ng p24 svakog pseudotipiziranog virusa tijekom 1 sata na 37 ° C, a zatim 1 × 104 HEK-ACE2 stanica dodano je u svaku jažicu. HEK293T stanice (koje ne izražavaju ACE2) inkubirane s pseudotipiziranim virusom (linija A) korištene su kao negativna kontrola. Stanice su lizirane 48 sati kasnije, a aktivnost luciferaze krijesnika mjerena je pomoću reagensa za ispitivanje luciferaze (Promega) u luminometru Glomax 96 Microplate (Promega). Izračunat je postotak neutralizacije za svako razrjeđivanje, a ID50 svakog uzorka izračunat je pomoću GraphPad Prism verzije 9.0.1.
Statističke analize
Statističke analize provedene su pomoću softvera GraphPad Prism verzije 9.1.2. Usporedbe više skupina za neutraliziranje titra antitijela (NAbT) protiv grupe pseudotipiziranih virusa SARS-CoV-2, kao i usporedbe odgovora NAb prema spolu i statusu dima provedene su pomoću uparenog Wilcoxonovog rangiranog testa. Faktorska promjena izračunata je kao razlika geometrijskog srednjeg titra u ID -u50 u usporedbi s virusom pseudotipiziranog tipa Wild. Korelacijska analiza između NAbT -a i dobi ili BMI provedena je pomoću Spearmanovog testa. Za statističku analizu zaraznosti provedeni su jednosmjerni ANOVA i Tukeyjev test višestruke usporedbe. Vrijednost p ≤ 0.05 smatrana je statistički značajnom.
Etičko odobrenje
Protokol studije odobrili su Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta na Universidad de Chile (projekti br. 0361-2021 i br. 096-2020) i Clínica Santa Maria (projekt br. 132604-21). Svi su donatori potpisali informirani pristanak, a njihovi uzorci su anonimizirani.
Utjecaj mutacija šiljaka u Lambda varijanti na infektivnost i reakcije neutraliziranja protutijela
Analiza 3695 sekvenci iz Čilea deponiranih u GISAID -u 24. lipnjath 2021. pokazuje jasnu dominaciju varijanti SARS-CoV-2 gama i lambda tijekom posljednjeg tromjesečja, zajedno, za 79% svih sekvenci.
Zanimljivo je da je ovo razdoblje karakterizirala masovna kampanja cijepljenja u kojoj je 65.6% ciljne populacije (18 godina i stariji pojedinci) primilo cjelovitu shemu cijepljenja do 27. lipnjath 2021
S obzirom na to da je 78.2% ljudi cijepljenih potpunim shemom primilo inaktivirano cjepivo protiv virusa CoronaVac iz tvrtke Sinovac Biotech, pokušali smo istražiti utjecaj mutacija šiljaka prisutnih u varijanti Lambda na neutralizirajuću sposobnost antitijela koja izaziva ovo cjepivo.
U tu svrhu generirali smo pseudotipizirane viruse SARS-CoV-1 zasnovane na HIV-2 koji nose protein spike iz referentne loze Wuhan-1 (divlji tip; loza A), mutacije D614G (loza B) i alfa (linija B .1.1.7), varijante Gama (linija P.1) i Lambda (linija C.37).
Tijekom pripreme virusa dosljedno smo promatrali da stanice zaražene pseudotipiziranim virusom koji nosi Lambda šiljak proizvode značajno veće vrijednosti bioluminiscencije u usporedbi s mutantom D614G ili varijantama Alpha i Gamma što ukazuje na povećanu infektivnost uzrokovanu proteinom Lambda šiljaka
Slika 1.Infektivnost posredovana različitim proteinima šiljaka.
(A) Shematski prikaz proteina šiljaka SARS-CoV-2 i varijante korištene u ovoj studiji. Loze su navedene u zagradama. RBD, domena koja veže receptore, CM; citoplazmatski rep.
(B) Titracija pseudotipova svake loze koristeći ekvivalentne količine HIV-1 p24. Aktivnost luciferaze krijesca mjerena je kao relativna jedinica luminiscencije (RLU) 48 sati nakon infekcije. Prosjek i SD izračunati su iz reprezentativnog trostrukog eksperimenta.
Zatim smo upotrijebili gore spomenute pseudotipizirane viruse za izvođenje testova neutralizacije koristeći 79 uzoraka plazme zdravih zdravstvenih radnika sa Universidad de Chile i Clínica Santa María u Santiagu, Čile.
Isključili smo 4 uzorka jer nismo mogli izračunati titar ID50. Od analiziranih uzoraka 73% odgovara ženama, prosječne dobi 34 godine (IQR 29 - 43) i indeksa tjelesnog maksimuma (BMI) 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% sudionika izjasnilo se da su aktivni pušači dok je trajalo razdoblje imunizacije. Uzorci su dobiveni u medijani od 95 dana (IQR 76 - 96) nakon druge doze cjepiva CoronaVac
Uočili smo da je neutraliziranje pseudotipiziranog virusa koji nosi šiljasti protein tipa Wild rezultiralo inhibicijskim razrjeđivanjem od 50% (ID50) srednji titar od 191.46 (154.9 - 227.95, 95% CI,), dok je bio 153.92 (115.68 - 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% CI) ) i 78.75 (49.8 - 107.6, 95% CI) za pseudotipizirane viruse koji nose spike protein iz D614G mutanta, odnosno varijante Alfa, Gama i Lambda.
Također smo primijetili da je geometrijski srednji titar ID -a50 titri su se smanjili za faktor 3.05 (2.57 - 3.61, 95% CI) za pseudotipizirani virus koji nosi Lambda šiljak, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% CI) za gama skok, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% CI) za šiljku Alpha i 1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) za šiljak D614G u usporedbi s šiljkom tipa Wild.
U našoj skupini ispitanika nije uočena korelacija između spola, dobi, indeksa tjelesne mase (BMI) ili statusa dima i neutralizirajućih titra antitijela.
Slika 2.Neutralizacijski test pomoću uzoraka plazme iz CoronaVac cjepiva
(A) Promjene u recipročnom titru neutralizacije od 50% (ID50) u uzorcima plazme 75 primatelja cjepiva CoronaVac protiv D614G (linija B), Alpha (linija B.1.1.7),
Varijante gama (linija P.1) i Lambda (linija C.37) u usporedbi s virusom divljeg tipa. Rezultati su prikazani kao razlika u titarima neutralizacije usklađenih uzoraka. P vrijednosti za usporedbu ID -a50 izračunavaju se Wilcoxonovim testom rangiranog ranga.
(B) Okvirne plohe ukazuju na medijan i interkvartilni raspon (IQR) ID -a50 za svaki pseudotipizirani virus. Faktorske promjene prikazane su kao razlika geometrijskog srednjeg titra u ID -u50 u usporedbi s onima za pseudotipizirani virus tipa Wild. Statističke analize provedene su pomoću Wilcoxonovog testa potpisanog ranga uparenih parova.
Zajedno, naši su podaci otkrili da proteinski šiljak novo priznate varijante interesa Lambda, koja jako cirkulira u Čileu i južnoameričkim zemljama, nosi mutacije koje daju povećanu infektivnost i sposobnost bijega iz neutralizirajućih antitijela koja izaziva CoronaVac.
